T7 RNA聚合酶

T7 RNA聚合酶

1. 產(chǎn)品描述

作為生物大分子，mRNA 只能通過體外轉錄（IVT，in vitro transcription）的方法大規(guī)模合成，T7 啟動子是目前轉錄效率***的啟動子之一，因此采用 T7 RNA 聚合酶（T7 RNA Polymerase）進行體外轉錄可獲得更多的合成產(chǎn)物。本制品 T7 RNA Polymerase（T7 RNA 聚合酶）為噬菌體 T7 DNA 編碼的酶，是一種高度特異識別 T7 啟動子序列的 DNA 依賴的 5'→3' RNA 聚合酶，以含有 T7 啟動子序列的單鏈或雙鏈 DNA 為模板，以 NTP 為底物，合成與 DNA 中一條鏈互補的 RNA。T7 RNA 聚合酶是體外轉錄生產(chǎn)治療用 mRNA 的關鍵酶。本品為利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達的 GMP 級重組 T7 RNA 聚合酶，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，并嚴格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等，符合GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。

2. 質(zhì)量要求

3. 遵循生產(chǎn)規(guī)范

1-《GMP 附錄-細胞治療產(chǎn)品》***藥品監(jiān)督管理局。
2-《人用基因治療總論-中國藥典2020》***藥典委。
3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細胞因子和生長因子。
5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細胞或基因治療藥物的生物來源原料。

4. 產(chǎn)品基本信息

5. 產(chǎn)品特點

5.1更好的酶活

通過定點突變技術，對 T7 啟動子有高度特異性。相同完整率下，遠高于市售主流競品的產(chǎn)率。

與KK競品對比測試，在3h反應時間下產(chǎn)量提升50.9%

與ZW競品對比測試，在3h反應時間下產(chǎn)量提升27.4%

5.2.更好的 凍融穩(wěn)定性

在37℃ 24h、凍融5次條件下，樣品穩(wěn)定。

5.3.完善嚴苛的質(zhì)量標準

獨立的SEC-HPLC分析方法開發(fā) RP-HPLC 分析方法開發(fā)

6. 產(chǎn)品用途

1- 合成單鏈 RNA，用于 mRNA 疫苗等制備。

2- 合成高特異性 RNA 探針。

3- 合成 siRNA 前體。

4- 制作 RNA 剪接反應（RNA splicing）的前體。

5- 利用帽類似物合成帶帽 RNA

7. 產(chǎn)品包裝

1- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (50U/μl)。

2- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (200U/μl)。

3- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (可定制規(guī)格)。

8. 注意事項

1- 模板效率和孵化時間： 不同模板的產(chǎn)量會因模板的序列、結構、長度、純度以及特定 RNA 聚合酶啟動子的序列和長度而有所不同。影響轉錄產(chǎn)量的污染物包括核糖核酸酶或污染物，如苯酚、微量金屬和 SDS。

2- 優(yōu)化的反應: 推薦的反應條件可適用于大多數(shù)模板的體外轉錄，但是，對于某些模板，可以通過延長反應時間(4 小時-過夜反應)， 增加模板的用量來提高產(chǎn)率。

3- 保持 RNase-free 環(huán)境：使用無 RNase 管和移液槍；處理含有 RNA 的試劑盒組件或樣品時應戴手套，并經(jīng)常更換手套，特別是接觸到 RNase 的潛在污染源，如門把手、 鋼筆、鉛筆和人體皮膚后。不使用時，應將所有試劑密封好。在孵育過程中，將所有含有 RNA 的試管密封。

4- 在配置反應體系時，可以加入 適當?shù)?span style=";padding: 0px;border: 0px;list-style: none">RNase 抑制劑。

5- 由于配套 Transcription Buffer 內(nèi)的成分濃度偏高，高鹽環(huán)境會導致聚合酶失活，同時 buffer 中含其它多種成分物質(zhì)，可能會與模板 DNA 形成沉淀，配制反應液時需調(diào)整組分加樣順序，計算好體系，先加水，然后加 Buffer，NTP，***加模板和酶，以防止反應buffer中的高濃度鹽離子對酶造成影響。

9. 模板制備

帶有雙鏈 T7 啟動子的線性化質(zhì)粒、PCR 產(chǎn)物或者合成的 DNA 片段都可以作為 T7 RNA Polymerase 體外轉錄模板，模板可用TE 緩沖液或 RNase-free Water 溶解。

1- 質(zhì)粒模板（建議每個反應加 1μg 線性化質(zhì)粒作為模板）帶 T7 啟動子的質(zhì)?？梢宰鳛檗D錄模板，質(zhì)粒的線性化和純度會影響轉錄的產(chǎn)量及 RNA 的完整性。環(huán)狀質(zhì)粒由于沒有有效的終止，會轉錄出不同長度的 RNA 產(chǎn)物，為了得到特定長度的 RNA，質(zhì)粒必須完全線性化，線性化的質(zhì)粒請確保雙鏈為平末端或編碼鏈 5‘端為突出結構。

2- PCR 產(chǎn)物模板（建議每個反應加 0.1μg~1μg 作為模板） 帶 T7 啟動子的 PCR 產(chǎn)物可以作為體外轉錄模板。PCR 擴增模板時將 T7 啟動子加在有義鏈的上游引物的 5’端。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后作為模板。

3- 合成的 DNA 模板（建議每個反應加 0.1μg~0.5μg 作為模板） 合成的帶有 T7 啟動子的 DNA 片段也可以作為體外轉錄的模板。

10. 體外轉錄實驗流程

1- 將各組分融化后分別混勻，短暫離心收集于管底，冰上儲存?zhèn)溆谩?/span>

2- 加入以下各組分：

注：根據(jù)實際情況可以在反應體系中可添加 RNase Inhibitor 至 1U/μl，防止實驗過程環(huán)境中RNase 污染。模板 DNA 應為 RNaseA-Free、高純度，建議 OD260/280 為 1.8~2.0。

3- 用移液器輕輕混勻各組分，并短暫離心收集，37℃孵育 2-3 h。 為避免蒸發(fā)對反應體系的影響，建議在 PCR 儀中進行反應?？筛鶕?jù)產(chǎn)物片段大小適當?shù)恼{(diào)整反應時間，如合成小于 0.3 kb 的 RNA，可將反應延長至 4 h 或更長時間，16 h 過夜反應不會影響產(chǎn)物的質(zhì)量。

4- 在反應體系中加入 1μl 的 DNase I ，37℃孵育 15 min，消化轉錄的 DNA 模板。相對于產(chǎn)物 RNA，模板 DNA 的含量非常低，一般不用去除，也可以用 DNase I 消化。

5- 合成的 RNA 經(jīng)電泳分析、純化后，可用于下游實驗。產(chǎn)物濃度極高，需用 RNase-free Water 稀釋后再檢測。