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mRNA純化:切向流過(guò)濾的應用

mRNA療法正逐漸成為許多疾病的重要治療方法。在治療過(guò)程中,將mRNA注射到患者體內,編碼體內相應的蛋白質(zhì)。為此,生產(chǎn)的mRNA產(chǎn)品需要具有高純度和安全保證。


mRNA在體內的持續時(shí)間通常很短,包括加工、翻譯、然后降解。通常需要進(jìn)行修飾以增強穩定性,包括骨架修飾、糖修飾或堿基修飾,此外,還包括N(5')-末端帶“帽”或C(3')-末端帶“尾”、“ cap" "通常是7-甲基鳥(niǎo)苷,它在真核細胞中的作用是耐受核酸酶?!拔舶汀蓖ǔ0ㄒ粋€(gè)多聚腺苷酸化,在mRNA的3'末端添加一個(gè)多聚腺苷酸基序,其作用是避免核酸外切酶降解。


mRNA 可以通過(guò)體外轉錄 (IVT) 合成。它需要一個(gè)線(xiàn)性或環(huán)狀 DNA 模板,其中包含啟動(dòng)子、三磷酸核糖核苷、包含 DTT 和鎂的緩沖系統以及合適的 RNA 聚合酶(如 T3、T7 或 SP6 RNA)。聚合酶)、DNAse I、焦磷酸酶和/或 RNAse 抑制劑。體外合成的mRNA長(cháng)度通常為1-5kb。


傳統的RNA純化方法多采用吸附柱,操作時(shí)使用乙醇等腐蝕性或易燃溶劑。在處理管理和規?;a(chǎn)中應盡量避免這種情況。此外,這種方法不能有效地分離出不完整的轉錄本,即“未成熟”的RNA序列,也稱(chēng)為“shortmers”,其長(cháng)度通常小于所需的轉錄本。這些雜質(zhì) RNA 是高度免疫刺激劑,當存在時(shí),它們可以極大地改變 mRNA 作為活性藥物成分 (API) 的毒性和耐受特性。


切向流過(guò)濾技術(shù)可有效用于體外合成mRNA的純化,有效去除反應底物、酶、副產(chǎn)物,特別是反應液中的“短鏈”,同時(shí)保持mRNA的完整性,切向流過(guò)濾只需要使用 水性緩沖液用作溶劑,不需要腐蝕性或易燃溶劑。此外,該方法符合藥品生產(chǎn)管理的要求。因此,切向流過(guò)濾是一種更有效、可靠和安全的 mRNA 純化方法,適用于大規模治療應用。


mRNA純化工藝步驟包括: a) 將體外合成的mRNA反應混合物置于變性條件下(如加入變性劑:尿素、氯化鉀、硫氰酸胍、SDS、孵育); b) 使用切向流過(guò)濾從混合物中純化 mRNA。


純化后的產(chǎn)品不應含有未成熟的 RNA 序列和體外合成過(guò)程中使用的酶試劑(包括 T7 RNA 聚合酶、DNAse I、焦磷酸酶和 RNAse 抑制劑)。一般來(lái)說(shuō),“未成熟”的RNA序列應該小于5%到檢測不到,或者小于15個(gè)堿基,純化后mRNA的完整性需要>95%到100%。


切向流過(guò)濾采用KrosFlo開(kāi)發(fā)的IIi切向流過(guò)濾系統,配備MidiKros 500kD 115cm^2 mPES中空纖維過(guò)濾模塊,循環(huán)流速~130mL/min,對應剪切速率~5000S-1。


實(shí)驗首先測試了體外合成的5mg螢火蟲(chóng)熒光素酶mRNA的處理,反應液總體積為2.24mL,5M尿素為變性劑,室溫孵育5min,轉移至TFF樣品容器中,NFW稀釋至 200mL 和 1200mL NFW 進(jìn)行超濾沖洗。然后,用 200 mL 10 mM 檸檬酸鈉處理,并用 600 mL NFW 切向流恒體積沖洗。***超濾濃縮至~2mL,260nm處測定濃度,轉染HEK293T細胞。培養后,檢測細胞裂解液中的 FFL。

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