mRNA療法正逐漸成為許多疾病的重要治療方法。在治療過(guò)程中，將mRNA注射到患者體內(nèi)，編碼體內(nèi)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。為此，生產(chǎn)的mRNA產(chǎn)品需要具有高純度和安全保證。
mRNA在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間通常很短，包括加工、翻譯、然后降解。通常需要進(jìn)行修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性，包括骨架修飾、糖修飾或堿基修飾，此外，還包括N(5')-末端帶“帽”或C(3')-末端帶“尾”、“ cap" "通常是7-甲基鳥(niǎo)苷，它在真核細(xì)胞中的作用是耐受核酸酶?！拔舶汀蓖ǔ０ㄒ粋€(gè)多聚腺苷酸化，在mRNA的3'末端添加一個(gè)多聚腺苷酸基序，其作用是避免核酸外切酶降解。
mRNA 可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 合成。它需要一個(gè)線性或環(huán)狀 DNA 模板，其中包含啟動(dòng)子、三磷酸核糖核苷、包含 DTT 和鎂的緩沖系統(tǒng)以及合適的 RNA 聚合酶（如 T3、T7 或 SP6 RNA）。聚合酶）、DNAse I、焦磷酸酶和/或 RNAse 抑制劑。體外合成的mRNA長(zhǎng)度通常為1-5kb。
傳統(tǒng)的RNA純化方法多采用吸附柱，操作時(shí)使用乙醇等腐蝕性或易燃溶劑。在處理管理和規(guī)?；a(chǎn)中應(yīng)盡量避免這種情況。此外，這種方法不能有效地分離出不完整的轉(zhuǎn)錄本，即“未成熟”的RNA序列，也稱(chēng)為“shortmers”，其長(zhǎng)度通常小于所需的轉(zhuǎn)錄本。這些雜質(zhì) RNA 是高度免疫刺激劑，當(dāng)存在時(shí)，它們可以極大地改變 mRNA 作為活性藥物成分 (API) 的毒性和耐受特性。
切向流過(guò)濾技術(shù)可有效用于體外合成mRNA的純化，有效去除反應(yīng)底物、酶、副產(chǎn)物，特別是反應(yīng)液中的“短鏈”，同時(shí)保持mRNA的完整性，切向流過(guò)濾只需要使用 水性緩沖液用作溶劑，不需要腐蝕性或易燃溶劑。此外，該方法符合藥品生產(chǎn)管理的要求。因此，切向流過(guò)濾是一種更有效、可靠和安全的 mRNA 純化方法，適用于大規(guī)模治療應(yīng)用。
mRNA純化工藝步驟包括： a) 將體外合成的mRNA反應(yīng)混合物置于變性條件下（如加入變性劑：尿素、氯化鉀、硫氰酸胍、SDS、孵育）； b) 使用切向流過(guò)濾從混合物中純化 mRNA。
純化后的產(chǎn)品不應(yīng)含有未成熟的 RNA 序列和體外合成過(guò)程中使用的酶試劑（包括 T7 RNA 聚合酶、DNAse I、焦磷酸酶和 RNAse 抑制劑）。一般來(lái)說(shuō)，“未成熟”的RNA序列應(yīng)該小于5%到檢測(cè)不到，或者小于15個(gè)堿基，純化后mRNA的完整性需要>95%到100%。
切向流過(guò)濾采用KrosFlo開(kāi)發(fā)的IIi切向流過(guò)濾系統(tǒng)，配備MidiKros 500kD 115cm^2 mPES中空纖維過(guò)濾模塊，循環(huán)流速~130mL/min，對(duì)應(yīng)剪切速率~5000S-1。
實(shí)驗(yàn)首先測(cè)試了體外合成的5mg螢火蟲(chóng)熒光素酶mRNA的處理，反應(yīng)液總體積為2.24mL，5M尿素為變性劑，室溫孵育5min，轉(zhuǎn)移至TFF樣品容器中，NFW稀釋至 200mL 和 1200mL NFW 進(jìn)行超濾沖洗。然后，用 200 mL 10 mM 檸檬酸鈉處理，并用 600 mL NFW 切向流恒體積沖洗。***超濾濃縮至~2mL，260nm處測(cè)定濃度，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。培養(yǎng)后，檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的 FFL。
