使用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系生產(chǎn)疫苗的概念相對(duì)較新，但受到越來(lái)越多的關(guān)注，尤其是病毒載體和VLP。該系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是即時(shí)（無(wú)需建立細(xì)胞系）和安全（無(wú)需完整的病毒 DNA）生產(chǎn)。
Cervarix 是葛蘭素史克針對(duì)人乳頭瘤病毒感染的 VLP 疫苗，是***種使用昆蟲細(xì)胞的商業(yè)人類疫苗。使用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的各種基于 VLP 和 rAAV 載體的疫苗也在開(kāi)發(fā)中。
源自草地夜蛾（SF9 和 SF21）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）（BTI-TN5B1-4）的昆蟲細(xì)胞系是***常用的細(xì)胞系，它們可以懸浮生長(zhǎng)，因此上游過(guò)程的放大更簡(jiǎn)單。在達(dá)到所需的活細(xì)胞密度后，對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用重組桿狀病毒感染進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。桿狀病毒基因組很大，可以表達(dá)5種以上不同的蛋白質(zhì)，也滿足了VLP和病毒載體的復(fù)雜性要求。
昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液的下游過(guò)程具有很大的可變性，這恰恰說(shuō)明了這種方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的多樣性。操作的***步受生物反應(yīng)器進(jìn)料和液體特性的影響很大，包括細(xì)胞密度、活性和產(chǎn)物釋放特性，如出芽分泌或細(xì)胞裂解。昆蟲細(xì)胞將在桿狀病毒感染后 3-5 天裂解。細(xì)胞裂解會(huì)釋放酶和其他可導(dǎo)致重組蛋白水解的物質(zhì)。應(yīng)特別注意。
不同的方法可用于細(xì)胞裂解，例如冷凍和解凍、表面活性劑、勻漿或超聲。昆蟲細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，所以它們?nèi)芙獾煤芸?。盡管超聲是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模***常用的技術(shù)，但很少用于中試或商業(yè)規(guī)模。一般在加入低濃度的表面活性劑后進(jìn)行高壓均質(zhì)處理。離心所得混合物以除去不溶性顆粒。此階段裂解液非常混濁，很難直接用過(guò)濾器過(guò)濾。添加核酸酶可以解決某些過(guò)濾問(wèn)題。收獲后，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液沖洗，并在含有裂解緩沖液的高鹽條件下快速冷凍和解凍，以幫助去除聚集體。
細(xì)胞裂解不僅會(huì)釋放病毒顆粒，還會(huì)釋放大量污染宿主核酸，因此昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的VLP和病毒載體非常難以澄清。昆蟲細(xì)胞可以生長(zhǎng)到更高的細(xì)胞密度，例如 1-9 x 10^6 個(gè)細(xì)胞/毫升。因此，澄清需要能夠處理高細(xì)胞密度、高核酸含量的液體，并去除桿狀病毒顆粒。
由于細(xì)胞密度高，離心一直是過(guò)去***的初始澄清方法。但膜技術(shù)是一個(gè)非常有吸引力的替代方案，因?yàn)樗菀讛U(kuò)大規(guī)模。深度過(guò)濾已成功用于輪狀病毒樣顆粒的下游過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，CsCl 密度梯度超速離心法也常用于復(fù)雜顆粒的純化，但其產(chǎn)量明顯低于結(jié)合表面活性劑、深層過(guò)濾和超濾的完整下游工藝。
另一個(gè)成功案例是使用 0.45μm 和 500kD 中空纖維來(lái)收集和濃縮昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的 HIV 病毒樣顆粒。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞完整性狀態(tài)優(yōu)化中空纖維的剪切速率，從而建立低剪切切割工藝以替代實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蔗糖梯度超速離心。該工藝可應(yīng)用于批量生產(chǎn)。
對(duì)于在細(xì)菌或酵母系統(tǒng)中表達(dá)的 VLP 疫苗，澄清方法的選擇取決于 VLP 是否釋放到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。如果VLP不能有效分泌，則需要進(jìn)行細(xì)胞裂解或其他提取操作才能澄清。盡管離心是行業(yè)用于澄清細(xì)菌或酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)黃金標(biāo)準(zhǔn)，但如今，膜技術(shù)因其可擴(kuò)展性和與一次性過(guò)程的兼容性而受到越來(lái)越多的關(guān)注。
研究已經(jīng)使用離心、TFF 或兩種方法的組合來(lái)制備和澄清大腸桿菌產(chǎn)生的 VLP。實(shí)驗(yàn)中，將高壓勻漿得到的大腸桿菌勻漿稀釋后，用0.45μm TFF膜在5℃下澄清。結(jié)果表明，基于TFF的膜技術(shù)適用于處理高粘度收獲液，尤其是中空纖維TFF模塊。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了使用離心代替TFF澄清的結(jié)果。相比之下，離心更麻煩。
