當前位置:首頁(yè)->資訊中心

病毒樣顆粒澄清策略

使用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細胞系生產(chǎn)疫苗的概念相對較新,但受到越來(lái)越多的關(guān)注,尤其是病毒載體和VLP。該系統的主要優(yōu)點(diǎn)是即時(shí)(無(wú)需建立細胞系)和安全(無(wú)需完整的病毒 DNA)生產(chǎn)。


Cervarix 是葛蘭素史克針對人乳頭瘤病毒感染的 VLP 疫苗,是***種使用昆蟲(chóng)細胞的商業(yè)人類(lèi)疫苗。使用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細胞系統的各種基于 VLP 和 rAAV 載體的疫苗也在開(kāi)發(fā)中。


源自草地夜蛾(SF9 和 SF21)和斜紋夜蛾(Spodoptera litura)(BTI-TN5B1-4)的昆蟲(chóng)細胞系是***常用的細胞系,它們可以懸浮生長(cháng),因此上游過(guò)程的放大更簡(jiǎn)單。在達到所需的活細胞密度后,對數期的細胞用重組桿狀病毒感染進(jìn)行蛋白質(zhì)表達。桿狀病毒基因組很大,可以表達5種以上不同的蛋白質(zhì),也滿(mǎn)足了VLP和病毒載體的復雜性要求。


昆蟲(chóng)細胞培養液的下游過(guò)程具有很大的可變性,這恰恰說(shuō)明了這種方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的多樣性。操作的***步受生物反應器進(jìn)料和液體特性的影響很大,包括細胞密度、活性和產(chǎn)物釋放特性,如出芽分泌或細胞裂解。昆蟲(chóng)細胞將在桿狀病毒感染后 3-5 天裂解。細胞裂解會(huì )釋放酶和其他可導致重組蛋白水解的物質(zhì)。應特別注意。


不同的方法可用于細胞裂解,例如冷凍和解凍、表面活性劑、勻漿或超聲。昆蟲(chóng)細胞沒(méi)有細胞壁,所以它們溶解得很快。盡管超聲是實(shí)驗室規模***常用的技術(shù),但很少用于中試或商業(yè)規模。一般在加入低濃度的表面活性劑后進(jìn)行高壓均質(zhì)處理。離心所得混合物以除去不溶性顆粒。此階段裂解液非?;鞚?,很難直接用過(guò)濾器過(guò)濾。添加核酸酶可以解決某些過(guò)濾問(wèn)題。收獲后,細胞用磷酸鹽緩沖液沖洗,并在含有裂解緩沖液的高鹽條件下快速冷凍和解凍,以幫助去除聚集體。


細胞裂解不僅會(huì )釋放病毒顆粒,還會(huì )釋放大量污染宿主核酸,因此昆蟲(chóng)細胞產(chǎn)生的VLP和病毒載體非常難以澄清。昆蟲(chóng)細胞可以生長(cháng)到更高的細胞密度,例如 1-9 x 10^6 個(gè)細胞/毫升。因此,澄清需要能夠處理高細胞密度、高核酸含量的液體,并去除桿狀病毒顆粒。


由于細胞密度高,離心一直是過(guò)去***的初始澄清方法。但膜技術(shù)是一個(gè)非常有吸引力的替代方案,因為它更容易擴大規模。深度過(guò)濾已成功用于輪狀病毒樣顆粒的下游過(guò)程。在實(shí)驗室規模,CsCl 密度梯度超速離心法也常用于復雜顆粒的純化,但其產(chǎn)量明顯低于結合表面活性劑、深層過(guò)濾和超濾的完整下游工藝。


另一個(gè)成功案例是使用 0.45μm 和 500kD 中空纖維來(lái)收集和濃縮昆蟲(chóng)細胞產(chǎn)生的 HIV 病毒樣顆粒。本實(shí)驗根據細胞完整性狀態(tài)優(yōu)化中空纖維的剪切速率,從而建立低剪切切割工藝以替代實(shí)驗室規模的蔗糖梯度超速離心。該工藝可應用于批量生產(chǎn)。


對于在細菌或酵母系統中表達的 VLP 疫苗,澄清方法的選擇取決于 VLP 是否釋放到細胞外培養基中。如果VLP不能有效分泌,則需要進(jìn)行細胞裂解或其他提取操作才能澄清。盡管離心是行業(yè)用于澄清細菌或酵母系統表達的蛋白質(zhì)的傳統黃金標準,但如今,膜技術(shù)因其可擴展性和與一次性過(guò)程的兼容性而受到越來(lái)越多的關(guān)注。


研究已經(jīng)使用離心、TFF 或兩種方法的組合來(lái)制備和澄清大腸桿菌產(chǎn)生的 VLP。實(shí)驗中,將高壓勻漿得到的大腸桿菌勻漿稀釋后,用0.45μm TFF膜在5℃下澄清。結果表明,基于TFF的膜技術(shù)適用于處理高粘度收獲液,尤其是中空纖維TFF模塊。同時(shí),實(shí)驗評估了使用離心代替TFF澄清的結果。相比之下,離心更麻煩。

加入我們

了解更多 >>

加入我們

了解更多 >>
Copyright © 2020滬ICP備2023005809號-1技術(shù)支持:逐鹿科技