當(dāng)前位置:首頁->資訊中心

樂布斯發(fā)布準(zhǔn)“藥品級”T7 RNA聚合酶

準(zhǔn)藥品級蛋白工具的由來


伴隨著新冠疫情的爆發(fā),催生了國外mRNA行業(yè)的火熱。國內(nèi)mRNA行業(yè)也在蓬勃發(fā)展,但當(dāng)前mRNA配套產(chǎn)業(yè)尚不成熟,相關(guān)質(zhì)量監(jiān)管體系并不健全。


mRNA 生產(chǎn)加工過程中的關(guān)鍵酶原料,占整個反應(yīng)過程中的重要成本。T7 RNA聚合酶是***通用的一種一步法IVT工具酶,按現(xiàn)行的法規(guī)文件既不屬于原料藥,也不屬于國家二類藥用輔料,同樣目前國家也還未出臺相關(guān)的指導(dǎo)性文件。相關(guān)酶工業(yè)無論是酶活鑒定方法、分析方法、質(zhì)控放行文件體系均各成一派,如何篩選出合規(guī)的酶原料供應(yīng)商,困擾著mRNA制藥人。


樂布斯團(tuán)隊(duì)有多年外資藥品研發(fā)經(jīng)驗(yàn)同時也是***早一批國產(chǎn)化制藥原料的從業(yè)者。深知現(xiàn)行國產(chǎn)化過程中的很多原料、耗材、器械的加工生產(chǎn)缺乏有效的GMP監(jiān)管體系跟質(zhì)量體系,無論是從產(chǎn)品的質(zhì)量、批間穩(wěn)定性、合規(guī)文件等均跟國際上存在顯著差距。一方面是我們很多的創(chuàng)業(yè)者是科研崗位出身,缺乏GMP概念及培訓(xùn);另一方面是這些年國產(chǎn)化在不斷的做大做多,玲瑯滿目的復(fù)制推新。導(dǎo)致了大量的產(chǎn)品紅海、資本紅海,然而恰恰忽略了復(fù)制之后的改良與創(chuàng)新。

國產(chǎn)化裝備耗材用戶詬病的問題諸如:小試產(chǎn)品數(shù)據(jù)非常漂亮,產(chǎn)業(yè)化后產(chǎn)品品控嚴(yán)重下降;產(chǎn)品批與批之間差異性極大,不敢用到關(guān)鍵物料或者關(guān)鍵工藝步驟中;QA現(xiàn)場審計(jì)發(fā)現(xiàn)不符合GMP規(guī)范,整改仍然不到位;文件體系非常欠缺,注冊申報及關(guān)聯(lián)審批憂心忡忡……


針對國產(chǎn)化過程中的通病與痛點(diǎn),樂布斯生物工程組建了擁有十幾年生物制品discovery、R&D、IND、NDA/BLA經(jīng)驗(yàn)的團(tuán)隊(duì),用制藥人的標(biāo)準(zhǔn)與思維為國產(chǎn)原料助力加碼。未來核酸藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域扮演的角色會越來越重要,我們不確定未來國家對關(guān)鍵原料的監(jiān)管及指導(dǎo)會到什么程度,如果標(biāo)準(zhǔn)的提高導(dǎo)致醫(yī)藥研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)無原料可用或者關(guān)聯(lián)審批原輔料廠家因?yàn)槲募w系不健全影響商業(yè)化進(jìn)度,或者因?yàn)楫a(chǎn)品的品質(zhì)或者批件穩(wěn)定性對藥品研發(fā)生產(chǎn)本身造成影響,非常得不償失。樂布斯生物工程團(tuán)隊(duì)一致決定,基于藥品的研發(fā)注冊商業(yè)化全流程開發(fā)配套的生物原料,建立完善的質(zhì)量管控體系、建立完整的文件體系。通過自身的努力,為行業(yè)樹立標(biāo)桿、為關(guān)鍵酶工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定奠定基礎(chǔ)。讓制藥人專心于藥品本身,而不是不同供應(yīng)商之間的考察審核中。


關(guān)于T7 RNA聚合酶


作為生物大分子,mRNA 只能通過體外轉(zhuǎn)錄(IVT,in vitro transcription)的方法大規(guī)模合成,T7 啟動子是目前轉(zhuǎn)錄效率***的啟動子之一,因此采用 T7 RNA 聚合酶(T7 RNA Polymerase)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄可獲得更多的合成產(chǎn)物。本制品 T7 RNA Polymerase(T7 RNA 聚合酶)為噬菌體 T7 DNA 編碼的酶,是一種高度特異識別 T7 啟動子序列的 DNA 依賴的 5'→3' RNA 聚合酶,以含有 T7 啟動子序列的單鏈或雙鏈 DNA 為模板,以 NTP 為底物,合成與 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA。T7 RNA 聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)治療用 mRNA 的關(guān)鍵酶。本品為利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)的 GMP 級重組 T7 RNA 聚合酶,采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn),并嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等,符合GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。


關(guān)于質(zhì)量體系


1.遵循藥品GMP質(zhì)量體系----不是藥品的“藥品”

√菌種溯源清晰,穩(wěn)定的商業(yè)化菌種

√QbD理念的工藝過程,可靠的活性及穩(wěn)定性

√載體溯源清晰,合規(guī)的商業(yè)化授權(quán)

√DOE方法確認(rèn),嚴(yán)格的批間穩(wěn)定性

√抗性符合藥典,藥品級菌種建庫

√藥品制造過程,完善的質(zhì)控及數(shù)據(jù)支持

√定點(diǎn)突變技術(shù),高效的酶催化活性

√藥典處方物料,完善的原料供應(yīng)商管理

√蛋白濃度,RP-HPLC精確定量

穩(wěn)定的比活,為生產(chǎn)投料偏差保駕護(hù)航

2.完善的放行檢測

項(xiàng)目

標(biāo)準(zhǔn)

外觀

應(yīng)為澄明液體

可見異物

不超過3個/支

裝量

出廠標(biāo)定裝量不低于額定裝量

鑒別(SDS-PAGE)

應(yīng)與參比條帶一致

蛋白濃度(RP-HPLC外標(biāo)法)

應(yīng)為標(biāo)識濃度的±10%

pH值

7.9±0.5

細(xì)菌內(nèi)毒素

<10EU/mL

非特異性核酸酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

核酸內(nèi)切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

核酸外切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

RNA酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

HCP殘留

≤50ng/mg

HCD殘留

≤100pg/mg

鎳鹽殘留

≤10ppm

重金屬殘留

≤10ppm

純度(SEC-HPLC)

≥95%

純度(RP-HPLC)

≥95%

活性

應(yīng)不低于50KU/mL

微生物限度

應(yīng)不高于1CFU/mL

3. 遵循生產(chǎn)規(guī)范

1-《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》國家藥品監(jiān)督管理局。

2-《人用基因治療總論-中國藥典2020》國家藥典委。

3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細(xì)胞治療,基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。

4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細(xì)胞因子和生長因子。

5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細(xì)胞或基因治療藥物的生物來源原料。

4. 產(chǎn)品基本信息

來源攜帶噬菌體T7 DNA基因的E.coli
儲存緩沖液50 mM Tris-HCl (pH 7.9);100 mM NaCl;10mM DTT;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100;50% (v/v) Glycerol
儲存條件-20±5℃

5. 產(chǎn)品特點(diǎn)

5.1更高的酶活

通過定點(diǎn)突變技術(shù),對 T7 啟動子有高度特異性。相同完整率下,高于市售主流競品的產(chǎn)率。


RNA生成量(μg)

時間(min)

KK市售產(chǎn)品

樂布斯產(chǎn)品

180

64.8

97.8

150

65.3

95.1

120

59

93.6

90

57.1

91.1

60

55.5

86.7

30

43.6

67.4

10

24.9

61.6


1.jpg











與KK競品對比測試,在3h反應(yīng)時間下產(chǎn)量提升50.9%

樣品名稱

200U/μl

濃度μg/μL

A260/A280

A260/A230

***終mRNA溶液體積

IVT反應(yīng)體系

折算產(chǎn)率

樂布斯產(chǎn)品

1783.9

1.97

2.16

0.5mL

100μL

8.92mg/mL

ZW市售產(chǎn)品

1400.3

1.94

2.14

0.5mL

100μL

7.00mg/mL

與ZW競品對比測試,在3h反應(yīng)時間下產(chǎn)量提升27.4%

5.2.準(zhǔn)確標(biāo)識蛋白濃度

我公司開發(fā)的RP-HPLC外標(biāo)法檢測蛋白濃度符合藥典規(guī)范,相比于市面上SDS-PAGE、Bradford、BCA等方法等擁有更高的準(zhǔn)確度與靈敏度。同時可以消除核酸等雜質(zhì)的影響。

5.3.雙標(biāo)法純度鑒定標(biāo)準(zhǔn)

我公司開發(fā)了SEC-HPLC、RP-HPLC雙標(biāo)法鑒定蛋白純度。
SEC-HPLC純度鑒定方法相比SDS-PAGE擁有更高的靈敏度、更規(guī)范的質(zhì)量管控。
SEC-HPLC無法鑒別氨基酸脫落、錯配、結(jié)構(gòu)修飾等,我公司額外開發(fā)了RP-HPLC用于檢測氨基酸脫落、錯配、修飾問題。


2.jpg


SEC-HPLC質(zhì)量分析 RP-HPLC質(zhì)量分析

5.4.比活研究

在酶制劑廠家往往忽略但是對mRNA企業(yè)非常重要的一個參數(shù),定義為每單位蛋白單位時間內(nèi)的RNA生成量。計(jì)算公式為:比活=活性/蛋白濃度,樂布斯將比活引入到樂布斯酶制劑的生產(chǎn)管理體系中。根據(jù)樂布斯產(chǎn)品質(zhì)量文件出廠標(biāo)識,可以計(jì)算出每批次的比活。比活更能反映出酶本身的活性及催化穩(wěn)定性,穩(wěn)定的比活可以大大降低投料的批間差,同時可以抑制沉淀等副反應(yīng)。從而保證工藝放大及批生產(chǎn)投料的穩(wěn)定性。

Test Item 檢驗(yàn)項(xiàng)目

Specification 標(biāo)準(zhǔn)

22P11-P20230201-G1

22P11-P20230201-G2

22P11-P20230202-G1

22P11-P20230202-G2

外觀

應(yīng)為澄明液體

無色澄明液體

無色澄明液體

無色澄明液體

無色澄明液體

可見異物

不超過3個/支

未見可見異物

未見可見異物

未見可見異物

未見可見異物

裝量

不少于標(biāo)識體積的100%

符合規(guī)定

符合規(guī)定

符合規(guī)定

符合規(guī)定

鑒別(SDS-Page)

應(yīng)與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

蛋白濃度(RP外標(biāo)法)

報告檢測值

0.56mg/ml

2.37mg/ml

0.45mg/ml

1.96mg/ml

pH

7.9±0.5

7.90

7.95

7.87

7.88

細(xì)菌內(nèi)毒素殘留

<10EU/mL

<10EU/mL

<10EU/mL

<10EU/mL

<10EU/mL

非特異性核酸酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

核酸內(nèi)切酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

核酸外切酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

RNA酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

HCP殘留

≤50ng/ mg

16.64ng/mg

16.07ng/mg

26.47ng/mg

22.50ng/mg

HCD殘留

≤100pg/ mg

<7.2pg/mg

<7.2pg/mg

<7.5pg/mg

<7.5pg/mg

鎳鹽殘留

≤10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

重金屬殘留

≤10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

純度(SEC-HPLC)

≥95.0%

99.88%

99.80%

99.84%

99.83%

純度(RP-HPLC)

≥95.0%

99.34%

99.70%

99.24%

99.78%

活性

應(yīng)不低于50KU/mL;

70.9 KU/mL

275.1 KU/mL

54.9 KU/mL

227.1 KU/mL

微生物限度

應(yīng)不高于1CFU/1mL

<1CFU/ml

<1CFU/ml

<1CFU/ml

<1CFU/ml

參考比活(KU/mg蛋白)


126.6KU/mg

116.1KU/mg

122.0KU/mg

115.9KU/mg

5.5凍融穩(wěn)定性


1.jpg

在37℃ 24h、凍融5次條件下,樣品穩(wěn)定。


5.6.CoA文件


1.jpg


CoA 樣本(50KU/mL) CoA 樣本(200KU/ml)

5.7.完善的文件體系

樂布斯建立了完善的文件體系,具體MSDS文件、RSF文件、DMF文件請向樂布斯工作人員索取。


關(guān)于樂布斯


樂布斯(上海)生物科技有限公司,是一家專注于新興生物治療市場分離制備相關(guān)耗材及工藝的供應(yīng)商。我公司主要研發(fā)、生產(chǎn)、經(jīng)營銷售細(xì)胞治療、基因治療、mRNA及核酸藥物工藝開發(fā)相關(guān)層析介質(zhì)、無菌定制流路、蛋白酶工程的加工生產(chǎn)以及相關(guān)工藝開發(fā)的綜合性公司。

我公司與南京大學(xué)、新西蘭奧克蘭大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、浙江大學(xué)、北京理工大學(xué)等眾多研究機(jī)構(gòu)合作。專注于細(xì)胞治療、基因治療、mRNA、小核酸、合成生物學(xué)專用層析介質(zhì)及工具酶的開發(fā)。


設(shè)有南京微球研發(fā)基地、安徽微球生產(chǎn)基地、河北衡水化學(xué)合成及后處理研發(fā)中心、山東淄博商業(yè)化車間。上海奉賢蛋白工程研發(fā)產(chǎn)業(yè)化基地。公司技術(shù)和研發(fā)實(shí)力雄厚,是國內(nèi)眾多生物醫(yī)藥上市企業(yè)信賴的長期合作伙伴。

樂布斯同時授權(quán)經(jīng)營國際知名品牌瑞普利金全系列工藝產(chǎn)品,主要代理產(chǎn)品為:XCell ATF灌流設(shè)備、Spectrum TFF切向流設(shè)備、中空纖維膜柱、平板膜包、層析系統(tǒng)、預(yù)裝層析柱、層析介質(zhì)。同時代理REBEL 全自動生化分析儀、 代理Implen 超微量分光光度計(jì)、代理安及義反應(yīng)器、水機(jī)等產(chǎn)品。


聯(lián)系地址:上海市浦東新區(qū)秀浦路3188 號創(chuàng)研智造D11棟306~308室

聯(lián)系電話:+86 021 2096 0216

郵 箱:service@labs-biotech.com


創(chuàng)研智造-D11棟上海市浦東新區(qū)疊橋路創(chuàng)研智造

加入我們

了解更多 >>

加入我們

了解更多 >>
Copyright © 2020滬ICP備2023005809號-1技術(shù)支持:逐鹿科技