準(zhǔn)藥品級蛋白工具的由來
伴隨著新冠疫情的爆發(fā)，催生了國外mRNA行業(yè)的火熱。國內(nèi)mRNA行業(yè)也在蓬勃發(fā)展，但當(dāng)前mRNA配套產(chǎn)業(yè)尚不成熟，相關(guān)質(zhì)量監(jiān)管體系并不健全。
mRNA 生產(chǎn)加工過程中的關(guān)鍵酶原料，占整個反應(yīng)過程中的重要成本。T7 RNA聚合酶是***通用的一種一步法IVT工具酶，按現(xiàn)行的法規(guī)文件既不屬于原料藥，也不屬于國家二類藥用輔料，同樣目前國家也還未出臺相關(guān)的指導(dǎo)性文件。相關(guān)酶工業(yè)無論是酶活鑒定方法、分析方法、質(zhì)控放行文件體系均各成一派，如何篩選出合規(guī)的酶原料供應(yīng)商，困擾著mRNA制藥人。
樂布斯團(tuán)隊(duì)有多年外資藥品研發(fā)經(jīng)驗(yàn)同時也是***早一批國產(chǎn)化制藥原料的從業(yè)者。深知現(xiàn)行國產(chǎn)化過程中的很多原料、耗材、器械的加工生產(chǎn)缺乏有效的GMP監(jiān)管體系跟質(zhì)量體系，無論是從產(chǎn)品的質(zhì)量、批間穩(wěn)定性、合規(guī)文件等均跟國際上存在顯著差距。一方面是我們很多的創(chuàng)業(yè)者是科研崗位出身，缺乏GMP概念及培訓(xùn)；另一方面是這些年國產(chǎn)化在不斷的做大做多，玲瑯滿目的復(fù)制推新。導(dǎo)致了大量的產(chǎn)品紅海、資本紅海，然而恰恰忽略了復(fù)制之后的改良與創(chuàng)新。
國產(chǎn)化裝備耗材用戶詬病的問題諸如：小試產(chǎn)品數(shù)據(jù)非常漂亮，產(chǎn)業(yè)化后產(chǎn)品品控嚴(yán)重下降；產(chǎn)品批與批之間差異性極大，不敢用到關(guān)鍵物料或者關(guān)鍵工藝步驟中；QA現(xiàn)場審計(jì)發(fā)現(xiàn)不符合GMP規(guī)范，整改仍然不到位；文件體系非常欠缺，注冊申報及關(guān)聯(lián)審批憂心忡忡……
針對國產(chǎn)化過程中的通病與痛點(diǎn)，樂布斯生物工程組建了擁有十幾年生物制品discovery、R&D、IND、NDA/BLA經(jīng)驗(yàn)的團(tuán)隊(duì)，用制藥人的標(biāo)準(zhǔn)與思維為國產(chǎn)原料助力加碼。未來核酸藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域扮演的角色會越來越重要，我們不確定未來國家對關(guān)鍵原料的監(jiān)管及指導(dǎo)會到什么程度，如果標(biāo)準(zhǔn)的提高導(dǎo)致醫(yī)藥研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)無原料可用或者關(guān)聯(lián)審批原輔料廠家因?yàn)槲募w系不健全影響商業(yè)化進(jìn)度，或者因?yàn)楫a(chǎn)品的品質(zhì)或者批件穩(wěn)定性對藥品研發(fā)生產(chǎn)本身造成影響，非常得不償失。樂布斯生物工程團(tuán)隊(duì)一致決定，基于藥品的研發(fā)注冊商業(yè)化全流程開發(fā)配套的生物原料，建立完善的質(zhì)量管控體系、建立完整的文件體系。通過自身的努力，為行業(yè)樹立標(biāo)桿、為關(guān)鍵酶工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定奠定基礎(chǔ)。讓制藥人專心于藥品本身，而不是不同供應(yīng)商之間的考察審核中。
關(guān)于T7 RNA聚合酶
作為生物大分子，mRNA 只能通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT，in vitro transcription）的方法大規(guī)模合成，T7 啟動子是目前轉(zhuǎn)錄效率***的啟動子之一，因此采用 T7 RNA 聚合酶（T7 RNA Polymerase）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄可獲得更多的合成產(chǎn)物。本制品 T7 RNA Polymerase（T7 RNA 聚合酶）為噬菌體 T7 DNA 編碼的酶，是一種高度特異識別 T7 啟動子序列的 DNA 依賴的 5'→3' RNA 聚合酶，以含有 T7 啟動子序列的單鏈或雙鏈 DNA 為模板，以 NTP 為底物，合成與 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA。T7 RNA 聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)治療用 mRNA 的關(guān)鍵酶。本品為利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)的 GMP 級重組 T7 RNA 聚合酶，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，并嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等，符合GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。
關(guān)于質(zhì)量體系
1.遵循藥品GMP質(zhì)量體系----不是藥品的“藥品”
√菌種溯源清晰，穩(wěn)定的商業(yè)化菌種 | √QbD理念的工藝過程，可靠的活性及穩(wěn)定性 |
√載體溯源清晰，合規(guī)的商業(yè)化授權(quán) | √DOE方法確認(rèn)，嚴(yán)格的批間穩(wěn)定性 |
√抗性符合藥典，藥品級菌種建庫 | √藥品制造過程，完善的質(zhì)控及數(shù)據(jù)支持 |
√定點(diǎn)突變技術(shù)，高效的酶催化活性 | √藥典處方物料，完善的原料供應(yīng)商管理 |
√蛋白濃度，RP-HPLC精確定量 | 穩(wěn)定的比活，為生產(chǎn)投料偏差保駕護(hù)航 |
2.完善的放行檢測
項(xiàng)目 | 標(biāo)準(zhǔn) |
外觀 | 應(yīng)為澄明液體 |
可見異物 | 不超過3個/支 |
裝量 | 出廠標(biāo)定裝量不低于額定裝量 |
鑒別（SDS-PAGE） | 應(yīng)與參比條帶一致 |
蛋白濃度（RP-HPLC外標(biāo)法） | 應(yīng)為標(biāo)識濃度的±10% |
pH值 | 7.9±0.5 |
細(xì)菌內(nèi)毒素 | ＜10EU/mL |
非特異性核酸酶殘留 | 瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性 |
核酸內(nèi)切酶殘留 | 瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性 |
核酸外切酶殘留 | 瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性 |
RNA酶殘留 | 瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性 |
HCP殘留 | ≤50ng/mg |
HCD殘留 | ≤100pg/mg |
鎳鹽殘留 | ≤10ppm |
重金屬殘留 | ≤10ppm |
純度（SEC-HPLC） | ≥95% |
純度（RP-HPLC） | ≥95% |
活性 | 應(yīng)不低于50KU/mL |
微生物限度 | 應(yīng)不高于1CFU/mL |
3. 遵循生產(chǎn)規(guī)范
1-《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》國家藥品監(jiān)督管理局。
2-《人用基因治療總論-中國藥典2020》國家藥典委。
3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細(xì)胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細(xì)胞因子和生長因子。
5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細(xì)胞或基因治療藥物的生物來源原料。
4. 產(chǎn)品基本信息
| 來源 | 攜帶噬菌體T7 DNA基因的E.coli |
| 儲存緩沖液 | 50 mM Tris-HCl (pH 7.9)；100 mM NaCl；10mM DTT；1 mM EDTA；0.1% Triton X-100；50% (v/v) Glycerol |
| 儲存條件 | -20±5℃ |
5. 產(chǎn)品特點(diǎn)
5.1更高的酶活
通過定點(diǎn)突變技術(shù)，對 T7 啟動子有高度特異性。相同完整率下，高于市售主流競品的產(chǎn)率。
RNA生成量（μg） | ||
時間（min） | KK市售產(chǎn)品 | 樂布斯產(chǎn)品 |
180 | 64.8 | 97.8 |
150 | 65.3 | 95.1 |
120 | 59 | 93.6 |
90 | 57.1 | 91.1 |
60 | 55.5 | 86.7 |
30 | 43.6 | 67.4 |
10 | 24.9 | 61.6 |
與KK競品對比測試，在3h反應(yīng)時間下產(chǎn)量提升50.9%
樣品名稱 200U/μl | 濃度μg/μL | A260/A280 | A260/A230 | ***終mRNA溶液體積 | IVT反應(yīng)體系 | 折算產(chǎn)率 |
樂布斯產(chǎn)品 | 1783.9 | 1.97 | 2.16 | 0.5mL | 100μL | 8.92mg/mL |
ZW市售產(chǎn)品 | 1400.3 | 1.94 | 2.14 | 0.5mL | 100μL | 7.00mg/mL |
與ZW競品對比測試，在3h反應(yīng)時間下產(chǎn)量提升27.4%
5.2.準(zhǔn)確標(biāo)識蛋白濃度
我公司開發(fā)的RP-HPLC外標(biāo)法檢測蛋白濃度符合藥典規(guī)范，相比于市面上SDS-PAGE、Bradford、BCA等方法等擁有更高的準(zhǔn)確度與靈敏度。同時可以消除核酸等雜質(zhì)的影響。
5.3.雙標(biāo)法純度鑒定標(biāo)準(zhǔn)
我公司開發(fā)了SEC-HPLC、RP-HPLC雙標(biāo)法鑒定蛋白純度。
SEC-HPLC純度鑒定方法相比SDS-PAGE擁有更高的靈敏度、更規(guī)范的質(zhì)量管控。
SEC-HPLC無法鑒別氨基酸脫落、錯配、結(jié)構(gòu)修飾等，我公司額外開發(fā)了RP-HPLC用于檢測氨基酸脫落、錯配、修飾問題。
SEC-HPLC質(zhì)量分析 RP-HPLC質(zhì)量分析
5.4.比活研究
在酶制劑廠家往往忽略但是對mRNA企業(yè)非常重要的一個參數(shù)，定義為每單位蛋白單位時間內(nèi)的RNA生成量。計(jì)算公式為：比活=活性/蛋白濃度，樂布斯將比活引入到樂布斯酶制劑的生產(chǎn)管理體系中。根據(jù)樂布斯產(chǎn)品質(zhì)量文件出廠標(biāo)識，可以計(jì)算出每批次的比活。比活更能反映出酶本身的活性及催化穩(wěn)定性，穩(wěn)定的比活可以大大降低投料的批間差，同時可以抑制沉淀等副反應(yīng)。從而保證工藝放大及批生產(chǎn)投料的穩(wěn)定性。
Test Item 檢驗(yàn)項(xiàng)目 | Specification 標(biāo)準(zhǔn) | 22P11-P20230201-G1 | 22P11-P20230201-G2 | 22P11-P20230202-G1 | 22P11-P20230202-G2 |
外觀 | 應(yīng)為澄明液體 | 無色澄明液體 | 無色澄明液體 | 無色澄明液體 | 無色澄明液體 |
可見異物 | 不超過3個/支 | 未見可見異物 | 未見可見異物 | 未見可見異物 | 未見可見異物 |
裝量 | 不少于標(biāo)識體積的100% | 符合規(guī)定 | 符合規(guī)定 | 符合規(guī)定 | 符合規(guī)定 |
鑒別（SDS-Page） | 應(yīng)與參比品條帶一致 | 與參比品條帶一致 | 與參比品條帶一致 | 與參比品條帶一致 | 與參比品條帶一致 |
蛋白濃度（RP外標(biāo)法） | 報告檢測值 | 0.56mg/ml | 2.37mg/ml | 0.45mg/ml | 1.96mg/ml |
pH | 7.9±0.5 | 7.90 | 7.95 | 7.87 | 7.88 |
細(xì)菌內(nèi)毒素殘留 | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL |
非特異性核酸酶殘留 | 瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 |
核酸內(nèi)切酶殘留 | 瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 |
核酸外切酶殘留 | 瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 |
RNA酶殘留 | 瓊脂糖凝膠電泳顯示應(yīng)為陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 |
HCP殘留 | ≤50ng/ mg | 16.64ng/mg | 16.07ng/mg | 26.47ng/mg | 22.50ng/mg |
HCD殘留 | ≤100pg/ mg | ＜7.2pg/mg | ＜7.2pg/mg | ＜7.5pg/mg | ＜7.5pg/mg |
鎳鹽殘留 | ≤10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm |
重金屬殘留 | ≤10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm |
純度（SEC-HPLC） | ≥95.0% | 99.88% | 99.80% | 99.84% | 99.83% |
純度（RP-HPLC） | ≥95.0% | 99.34% | 99.70% | 99.24% | 99.78% |
活性 | 應(yīng)不低于50KU/mL; | 70.9 KU/mL | 275.1 KU/mL | 54.9 KU/mL | 227.1 KU/mL |
微生物限度 | 應(yīng)不高于1CFU/1mL | ＜1CFU/ml | ＜1CFU/ml | ＜1CFU/ml | ＜1CFU/ml |
參考比活（KU/mg蛋白） | 126.6KU/mg | 116.1KU/mg | 122.0KU/mg | 115.9KU/mg |
5.5凍融穩(wěn)定性
在37℃ 24h、凍融5次條件下，樣品穩(wěn)定。
5.6.CoA文件
CoA 樣本（50KU/mL） CoA 樣本（200KU/ml）
5.7.完善的文件體系
樂布斯建立了完善的文件體系，具體MSDS文件、RSF文件、DMF文件請向樂布斯工作人員索取。
關(guān)于樂布斯
樂布斯(上海)生物科技有限公司，是一家專注于新興生物治療市場分離制備相關(guān)耗材及工藝的供應(yīng)商。我公司主要研發(fā)、生產(chǎn)、經(jīng)營銷售細(xì)胞治療、基因治療、mRNA及核酸藥物工藝開發(fā)相關(guān)層析介質(zhì)、無菌定制流路、蛋白酶工程的加工生產(chǎn)以及相關(guān)工藝開發(fā)的綜合性公司。
我公司與南京大學(xué)、新西蘭奧克蘭大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、浙江大學(xué)、北京理工大學(xué)等眾多研究機(jī)構(gòu)合作。專注于細(xì)胞治療、基因治療、mRNA、小核酸、合成生物學(xué)專用層析介質(zhì)及工具酶的開發(fā)。
設(shè)有南京微球研發(fā)基地、安徽微球生產(chǎn)基地、河北衡水化學(xué)合成及后處理研發(fā)中心、山東淄博商業(yè)化車間。上海奉賢蛋白工程研發(fā)產(chǎn)業(yè)化基地。公司技術(shù)和研發(fā)實(shí)力雄厚，是國內(nèi)眾多生物醫(yī)藥上市企業(yè)信賴的長期合作伙伴。
樂布斯同時授權(quán)經(jīng)營國際知名品牌瑞普利金全系列工藝產(chǎn)品，主要代理產(chǎn)品為：XCell ATF灌流設(shè)備、Spectrum TFF切向流設(shè)備、中空纖維膜柱、平板膜包、層析系統(tǒng)、預(yù)裝層析柱、層析介質(zhì)。同時代理REBEL 全自動生化分析儀、 代理Implen 超微量分光光度計(jì)、代理安及義反應(yīng)器、水機(jī)等產(chǎn)品。
聯(lián)系地址：上海市浦東新區(qū)秀浦路3188 號創(chuàng)研智造D11棟306~308室
聯(lián)系電話：+86 021 2096 0216
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