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樂(lè )布斯發(fā)布準“藥品級”T7 RNA聚合酶

準藥品級蛋白工具的由來(lái)


伴隨著(zhù)新冠疫情的爆發(fā),催生了國外mRNA行業(yè)的火熱。國內mRNA行業(yè)也在蓬勃發(fā)展,但當前mRNA配套產(chǎn)業(yè)尚不成熟,相關(guān)質(zhì)量監管體系并不健全。


mRNA 生產(chǎn)加工過(guò)程中的關(guān)鍵酶原料,占整個(gè)反應過(guò)程中的重要成本。T7 RNA聚合酶是***通用的一種一步法IVT工具酶,按現行的法規文件既不屬于原料藥,也不屬于國家二類(lèi)藥用輔料,同樣目前國家也還未出臺相關(guān)的指導性文件。相關(guān)酶工業(yè)無(wú)論是酶活鑒定方法、分析方法、質(zhì)控放行文件體系均各成一派,如何篩選出合規的酶原料供應商,困擾著(zhù)mRNA制藥人。


樂(lè )布斯團隊有多年外資藥品研發(fā)經(jīng)驗同時(shí)也是***早一批國產(chǎn)化制藥原料的從業(yè)者。深知現行國產(chǎn)化過(guò)程中的很多原料、耗材、器械的加工生產(chǎn)缺乏有效的GMP監管體系跟質(zhì)量體系,無(wú)論是從產(chǎn)品的質(zhì)量、批間穩定性、合規文件等均跟國際上存在顯著(zhù)差距。一方面是我們很多的創(chuàng )業(yè)者是科研崗位出身,缺乏GMP概念及培訓;另一方面是這些年國產(chǎn)化在不斷的做大做多,玲瑯滿(mǎn)目的復制推新。導致了大量的產(chǎn)品紅海、資本紅海,然而恰恰忽略了復制之后的改良與創(chuàng )新。

國產(chǎn)化裝備耗材用戶(hù)詬病的問(wèn)題諸如:小試產(chǎn)品數據非常漂亮,產(chǎn)業(yè)化后產(chǎn)品品控嚴重下降;產(chǎn)品批與批之間差異性極大,不敢用到關(guān)鍵物料或者關(guān)鍵工藝步驟中;QA現場(chǎng)審計發(fā)現不符合GMP規范,整改仍然不到位;文件體系非常欠缺,注冊申報及關(guān)聯(lián)審批憂(yōu)心忡忡……


針對國產(chǎn)化過(guò)程中的通病與痛點(diǎn),樂(lè )布斯生物工程組建了擁有十幾年生物制品discovery、R&D、IND、NDA/BLA經(jīng)驗的團隊,用制藥人的標準與思維為國產(chǎn)原料助力加碼。未來(lái)核酸藥物在醫藥領(lǐng)域扮演的角色會(huì )越來(lái)越重要,我們不確定未來(lái)國家對關(guān)鍵原料的監管及指導會(huì )到什么程度,如果標準的提高導致醫藥研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)無(wú)原料可用或者關(guān)聯(lián)審批原輔料廠(chǎng)家因為文件體系不健全影響商業(yè)化進(jìn)度,或者因為產(chǎn)品的品質(zhì)或者批件穩定性對藥品研發(fā)生產(chǎn)本身造成影響,非常得不償失。樂(lè )布斯生物工程團隊一致決定,基于藥品的研發(fā)注冊商業(yè)化全流程開(kāi)發(fā)配套的生物原料,建立完善的質(zhì)量管控體系、建立完整的文件體系。通過(guò)自身的努力,為行業(yè)樹(shù)立標桿、為關(guān)鍵酶工業(yè)標準制定奠定基礎。讓制藥人專(zhuān)心于藥品本身,而不是不同供應商之間的考察審核中。


關(guān)于T7 RNA聚合酶


作為生物大分子,mRNA 只能通過(guò)體外轉錄(IVT,in vitro transcription)的方法大規模合成,T7 啟動(dòng)子是目前轉錄效率***的啟動(dòng)子之一,因此采用 T7 RNA 聚合酶(T7 RNA Polymerase)進(jìn)行體外轉錄可獲得更多的合成產(chǎn)物。本制品 T7 RNA Polymerase(T7 RNA 聚合酶)為噬菌體 T7 DNA 編碼的酶,是一種高度特異識別 T7 啟動(dòng)子序列的 DNA 依賴(lài)的 5'→3' RNA 聚合酶,以含有 T7 啟動(dòng)子序列的單鏈或雙鏈 DNA 為模板,以 NTP 為底物,合成與 DNA 中一條鏈互補的 RNA。T7 RNA 聚合酶是體外轉錄生產(chǎn)治療用 mRNA 的關(guān)鍵酶。本品為利用大腸桿菌大規模發(fā)酵表達的 GMP 級重組 T7 RNA 聚合酶,采用藥用規格原輔料生產(chǎn),并嚴格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等,符合GMP 規范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規程保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。


關(guān)于質(zhì)量體系


1.遵循藥品GMP質(zhì)量體系----不是藥品的“藥品”

√菌種溯源清晰,穩定的商業(yè)化菌種

√QbD理念的工藝過(guò)程,可靠的活性及穩定性

√載體溯源清晰,合規的商業(yè)化授權

√DOE方法確認,嚴格的批間穩定性

√抗性符合藥典,藥品級菌種建庫

√藥品制造過(guò)程,完善的質(zhì)控及數據支持

√定點(diǎn)突變技術(shù),高效的酶催化活性

√藥典處方物料,完善的原料供應商管理

√蛋白濃度,RP-HPLC精確定量

穩定的比活,為生產(chǎn)投料偏差保駕護航

2.完善的放行檢測

項目

標準

外觀(guān)

應為澄明液體

可見(jiàn)異物

不超過(guò)3個(gè)/支

裝量

出廠(chǎng)標定裝量不低于額定裝量

鑒別(SDS-PAGE)

應與參比條帶一致

蛋白濃度(RP-HPLC外標法)

應為標識濃度的±10%

pH值

7.9±0.5

細菌內毒素

<10EU/mL

非特異性核酸酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

核酸內切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

核酸外切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

RNA酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

HCP殘留

≤50ng/mg

HCD殘留

≤100pg/mg

鎳鹽殘留

≤10ppm

重金屬殘留

≤10ppm

純度(SEC-HPLC)

≥95%

純度(RP-HPLC)

≥95%

活性

應不低于50KU/mL

微生物限度

應不高于1CFU/mL

3. 遵循生產(chǎn)規范

1-《GMP 附錄-細胞治療產(chǎn)品》國家藥品監督管理局。

2-《人用基因治療總論-中國藥典2020》國家藥典委。

3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療,基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。

4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中細胞因子和生長(cháng)因子。

5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細胞或基因治療藥物的生物來(lái)源原料。

4. 產(chǎn)品基本信息

來(lái)源攜帶噬菌體T7 DNA基因的E.coli
儲存緩沖液50 mM Tris-HCl (pH 7.9);100 mM NaCl;10mM DTT;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100;50% (v/v) Glycerol
儲存條件-20±5℃

5. 產(chǎn)品特點(diǎn)

5.1更高的酶活

通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù),對 T7 啟動(dòng)子有高度特異性。相同完整率下,高于市售主流競品的產(chǎn)率。


RNA生成量(μg)

時(shí)間(min)

KK市售產(chǎn)品

樂(lè )布斯產(chǎn)品

180

64.8

97.8

150

65.3

95.1

120

59

93.6

90

57.1

91.1

60

55.5

86.7

30

43.6

67.4

10

24.9

61.6


1.jpg











與KK競品對比測試,在3h反應時(shí)間下產(chǎn)量提升50.9%

樣品名稱(chēng)

200U/μl

濃度μg/μL

A260/A280

A260/A230

***終mRNA溶液體積

IVT反應體系

折算產(chǎn)率

樂(lè )布斯產(chǎn)品

1783.9

1.97

2.16

0.5mL

100μL

8.92mg/mL

ZW市售產(chǎn)品

1400.3

1.94

2.14

0.5mL

100μL

7.00mg/mL

與ZW競品對比測試,在3h反應時(shí)間下產(chǎn)量提升27.4%

5.2.準確標識蛋白濃度

我公司開(kāi)發(fā)的RP-HPLC外標法檢測蛋白濃度符合藥典規范,相比于市面上SDS-PAGE、Bradford、BCA等方法等擁有更高的準確度與靈敏度。同時(shí)可以消除核酸等雜質(zhì)的影響。

5.3.雙標法純度鑒定標準

我公司開(kāi)發(fā)了SEC-HPLC、RP-HPLC雙標法鑒定蛋白純度。
SEC-HPLC純度鑒定方法相比SDS-PAGE擁有更高的靈敏度、更規范的質(zhì)量管控。
SEC-HPLC無(wú)法鑒別氨基酸脫落、錯配、結構修飾等,我公司額外開(kāi)發(fā)了RP-HPLC用于檢測氨基酸脫落、錯配、修飾問(wèn)題。


2.jpg


SEC-HPLC質(zhì)量分析 RP-HPLC質(zhì)量分析

5.4.比活研究

在酶制劑廠(chǎng)家往往忽略但是對mRNA企業(yè)非常重要的一個(gè)參數,定義為每單位蛋白單位時(shí)間內的RNA生成量。計算公式為:比活=活性/蛋白濃度,樂(lè )布斯將比活引入到樂(lè )布斯酶制劑的生產(chǎn)管理體系中。根據樂(lè )布斯產(chǎn)品質(zhì)量文件出廠(chǎng)標識,可以計算出每批次的比活。比活更能反映出酶本身的活性及催化穩定性,穩定的比活可以大大降低投料的批間差,同時(shí)可以抑制沉淀等副反應。從而保證工藝放大及批生產(chǎn)投料的穩定性。

Test Item 檢驗項目

Specification 標準

22P11-P20230201-G1

22P11-P20230201-G2

22P11-P20230202-G1

22P11-P20230202-G2

外觀(guān)

應為澄明液體

無(wú)色澄明液體

無(wú)色澄明液體

無(wú)色澄明液體

無(wú)色澄明液體

可見(jiàn)異物

不超過(guò)3個(gè)/支

未見(jiàn)可見(jiàn)異物

未見(jiàn)可見(jiàn)異物

未見(jiàn)可見(jiàn)異物

未見(jiàn)可見(jiàn)異物

裝量

不少于標識體積的100%

符合規定

符合規定

符合規定

符合規定

鑒別(SDS-Page)

應與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

與參比品條帶一致

蛋白濃度(RP外標法)

報告檢測值

0.56mg/ml

2.37mg/ml

0.45mg/ml

1.96mg/ml

pH

7.9±0.5

7.90

7.95

7.87

7.88

細菌內毒素殘留

<10EU/mL

<10EU/mL

<10EU/mL

<10EU/mL

<10EU/mL

非特異性核酸酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

核酸內切酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

核酸外切酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

RNA酶殘留

瓊脂糖凝膠電泳顯示應為陰性

陰性

陰性

陰性

陰性

HCP殘留

≤50ng/ mg

16.64ng/mg

16.07ng/mg

26.47ng/mg

22.50ng/mg

HCD殘留

≤100pg/ mg

<7.2pg/mg

<7.2pg/mg

<7.5pg/mg

<7.5pg/mg

鎳鹽殘留

≤10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

重金屬殘留

≤10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

<10ppm

純度(SEC-HPLC)

≥95.0%

99.88%

99.80%

99.84%

99.83%

純度(RP-HPLC)

≥95.0%

99.34%

99.70%

99.24%

99.78%

活性

應不低于50KU/mL;

70.9 KU/mL

275.1 KU/mL

54.9 KU/mL

227.1 KU/mL

微生物限度

應不高于1CFU/1mL

<1CFU/ml

<1CFU/ml

<1CFU/ml

<1CFU/ml

參考比活(KU/mg蛋白)


126.6KU/mg

116.1KU/mg

122.0KU/mg

115.9KU/mg

5.5凍融穩定性


1.jpg

在37℃ 24h、凍融5次條件下,樣品穩定。


5.6.CoA文件


1.jpg


CoA 樣本(50KU/mL) CoA 樣本(200KU/ml)

5.7.完善的文件體系

樂(lè )布斯建立了完善的文件體系,具體MSDS文件、RSF文件、DMF文件請向樂(lè )布斯工作人員索取。


關(guān)于樂(lè )布斯


樂(lè )布斯(上海)生物科技有限公司,是一家專(zhuān)注于新興生物治療市場(chǎng)分離制備相關(guān)耗材及工藝的供應商。我公司主要研發(fā)、生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)銷(xiāo)售細胞治療、基因治療、mRNA及核酸藥物工藝開(kāi)發(fā)相關(guān)層析介質(zhì)、無(wú)菌定制流路、蛋白酶工程的加工生產(chǎn)以及相關(guān)工藝開(kāi)發(fā)的綜合性公司。

我公司與南京大學(xué)、新西蘭奧克蘭大學(xué)、復旦大學(xué)、浙江大學(xué)、北京理工大學(xué)等眾多研究機構合作。專(zhuān)注于細胞治療、基因治療、mRNA、小核酸、合成生物學(xué)專(zhuān)用層析介質(zhì)及工具酶的開(kāi)發(fā)。


設有南京微球研發(fā)基地、安徽微球生產(chǎn)基地、河北衡水化學(xué)合成及后處理研發(fā)中心、山東淄博商業(yè)化車(chē)間。上海奉賢蛋白工程研發(fā)產(chǎn)業(yè)化基地。公司技術(shù)和研發(fā)實(shí)力雄厚,是國內眾多生物醫藥上市企業(yè)信賴(lài)的長(cháng)期合作伙伴。

樂(lè )布斯同時(shí)授權經(jīng)營(yíng)國際知名品牌瑞普利金全系列工藝產(chǎn)品,主要代理產(chǎn)品為:XCell ATF灌流設備、Spectrum TFF切向流設備、中空纖維膜柱、平板膜包、層析系統、預裝層析柱、層析介質(zhì)。同時(shí)代理REBEL 全自動(dòng)生化分析儀、 代理Implen 超微量分光光度計、代理安及義反應器、水機等產(chǎn)品。


聯(lián)系地址:上海市浦東新區秀浦路3188 號創(chuàng )研智造D11棟306~308室

聯(lián)系電話(huà):+86 021 2096 0216

郵 箱:service@labs-biotech.com


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